Strukturbiochemie/Enzymregulation/Allosterische Kontrolle
Allosterische Kontrolle bezieht sich auf eine Art der Enzymregulation, bei der ein Nicht-Substratmolekül, der so genannte allosterische Effektor, an anderen Stellen des Enzyms als dem aktiven Zentrum gebunden wird. Der Name „allo“ bedeutet „anders“ und „sterisch“ bezieht sich auf eine Position in einem bestimmten Raum. Mit anderen Worten, allosterisch bedeutet „an einem anderen Ort“. Eine allosterische Stelle ist eine Stelle, an der ein kleines regulatorisches Molekül mit einem Enzym interagiert, um dieses spezifische Enzym zu hemmen oder zu aktivieren; dies ist eine andere Stelle als die aktive Stelle, an der die katalytische Aktivität stattfindet. Die Bindung des allosterischen Effektors ist im Allgemeinen nicht kovalent und reversibel. Durch diese Wechselwirkung verändert sich die Form des Enzyms, was wiederum die Form des aktiven Zentrums verändert. Durch diese Konformationsänderung wird die Katalyse einer Reaktion entweder gehemmt oder verstärkt. Die allosterische Kontrolle ermöglicht es der Zelle also, die benötigten Substanzen durch Hemmung und/oder Verstärkung schnell zu regulieren.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. Die hemmende Wirkung von CTP, die stimulierende Wirkung von ATP und die kooperative Bindung von Substaten gehen alle mit großen Veränderungen in der quaternären Struktur der ATCase einher.
- Jede r-Kette der regulatorischen Untereinheit bindet mit einer c-Kette des katalytischen Trimers. Der Kontaktbereich zwischen der r-Kette und der c-Kette wird durch eine Zinkdomäne stabilisiert, die an Histidinreste in der r-Kette gebunden ist. Alle c-Ketten haben Kontakt mit der regulatorischen Untereinheit.
Die katalytischen und regulatorischen Untereinheiten können durch Zugabe einer Quecksilberverbindung und anschließende Ultrazentrifugation getrennt werden. Die Quecksilberverbindung unterbricht die Verbindung, da sie das Zinkion verdrängt und die r-Untereinheit destabilisiert. Die Reaktion folgt nicht dem Michaelis-Menten-Verhalten, sondern weist eine sigmoidale Kurve auf, da sich die Substratkonzentration durch die Regulierung durch andere Moleküle und die Bindungswahrscheinlichkeit ändert. Die Zugabe von mehr Substrat hat zwei Auswirkungen: Zum einen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass das Enzym mehr als ein Substratmolekül bindet, zum anderen steigt die durchschnittliche Menge der an jedes Enzym gebundenen Substrate. Mehr Substrat begünstigt letztlich den R-Zustand der ATCase, da das Gleichgewicht von der Anzahl der aktiven Stellen abhängt, die durch das Substrat besetzt sind, was dem Michaelis-Menten-Verhalten völlig entgegengesetzt ist.
KineticsEdit
Allosterische Enzyme zeigen eher eine sigmoide Kinetik als eine Michaelis-Menton-Kinetik. Dies liegt daran, dass das Enzym zwischen zwei verschiedenen Konformationszuständen oszilliert, ähnlich wie Hämoglobin.
- Der T-Zustand ist durch eine niedrige Substrataffinität und eine geringe katalytische Aktivität gekennzeichnet.
- In der R-Zustandskonformation gibt es eine 12Å Trennung zwischen den katalytischen Trimeren und eine ungefähr 10° Rotation um die zentrale Achse. Auch die regulatorischen Untereinheiten haben eine Drehung von etwa 15°. Die Konformation im R-Zustand ist durch eine Erhöhung der Substratkonzentration gekennzeichnet, die gleichzeitig die Reaktivität der ATCase in Vorbereitung auf den enzymatischen Weg der CTP-Produktion erhöht.
Allosterische Aktivierung
Nach der Substratbindung an der aktiven Stelle, die sich in der Tasche zwischen den c-Ketten im Trimer befindet, hat die ATCase eine größere Wahrscheinlichkeit, in den R-Zustand zu wechseln, da die Substratbindung den R-Zustand stabilisiert. Die Bindung von Substraten verschiebt das Gleichgewicht mehr in Richtung des R-Zustands, indem sie die Wahrscheinlichkeit
erhöht, dass jedes Enzym bindet und die durchschnittliche Anzahl der gebundenen Substrate erhöht (Kooperativität).
ATP kann auch an die regulatorische Stelle der ATCase binden, aber ATP hemmt die Aktivität der ATCase nicht, sondern erhöht sie sogar. Bei hohen ATP-Konzentrationen kann ATP also als Konkurrent von CTP um die regulatorische Stelle wirken. Die Aktivität der ATCase kann also mit steigender ATP-Konzentration zunehmen. Für diese Aktivitätssteigerung gibt es möglicherweise physiologische Erklärungen. Ein hoher ATP-Gehalt bedeutet eine hohe Konzentration von Purinnukleotiden, so dass die erhöhte ATCase-Aktivität die Konzentration von Pyrimidinen erhöht. Die Konzentration von Purinen und Pyrimidinen wird also ausgeglichener. Viel ATP in der Zelle bedeutet auch, dass Energie für Prozesse wie die mRNA-Synthese und die DNA-Replikation zur Verfügung steht, so dass die ATCase die Menge an Pyrimidinen erhöhen kann, die dann für diese Prozesse verwendet werden können.
PALAEdit
In Gegenwart von N-(Phosphonacetyl)-L-asparat (PALA), einem Bisubstrat-Analogon, das dem Substrat-Zwischenprodukt auf dem enzymatischen Weg ähnelt, hemmt PALA die ATCase, die sich an die aktiven Stellen bindet. Die Hemmung zeigte jedoch die Veränderung der quaternären Struktur nach der Bindung von PALA. Zwei katalytische Trimere werden in ihren jeweiligen T- und R-Zuständen isoliert. Diese Hemmung ist nicht allosterisch, sondern führt stattdessen die katalytischen Untereinheiten ein, die für die allosterische Hemmung dieses vollständigen Rückkopplungshemmungswegs verantwortlich sind.
T-Zustand vs. R-ZustandDer T-Zustand ist dafür bekannt, dass er das Molekül anspannt, was die Menge an Substrat erhöht, die benötigt wird, um an das Enzym bei 1/2 Vmax (Km) zu binden. Der T-Zustand ist weniger aktiv und wird durch die CTP-Bindung begünstigt. Die Wirkung von CTP ist, dass der T-Zustand stabilisiert wird. Dies bedeutet, dass es schwieriger ist, das Enzym in den R-Zustand zu überführen. Andererseits ist der R-Zustand bekanntermaßen entspannter und senkt den Km-Wert. Wenn die Konzentration des Substrats steigt, verschiebt sich das Gleichgewicht vom T-Zustand zum R-Zustand. Im R-Zustand ist das Molekül aktiver, d. h. die Substratbindung wird begünstigt. Die Wirkung von ATP auf den R-Zustand besteht darin, dass er stabilisiert wird, was die Bindung von Substraten erleichtert.
Homotrope Effekte — Substrateffekte auf allosterische Enzyme.
Heterotrope Effekte —Auswirkungen von Nicht-Substrat-Molekülen auf allosterische Enzyme wie CTP und ATP auf ATCase
Allosterische HemmungBearbeiten
Cytidintriphosphat (CTP), das Endprodukt der ATCase, wirkt als allosterischer Regulator. Carbamoylphosphat und Aspartat kondensieren zu einem N-Carbamoylaspartat-Zwischenprodukt, das dann CTP bildet. CTP bindet an die r-Kette der regulatorischen Untereinheit, die nicht in Kontakt mit den c-Ketten steht. Die Bindung von CTP stabilisiert den T-Zustand und senkt die Substrataffinität. Obwohl die Bindungsstelle an der regulatorischen Untereinheit weit von der katalytischen Untereinheit entfernt ist, führt die Bindung zu quaternären Strukturveränderungen, die die Stabilisierung des T-Zustands und die Hemmung fördern. Dadurch verschiebt sich die sigmoidale Kurve nach rechts. Die Reaktion läuft bei einer niedrigen Konzentration von schnell ab, aber bei höheren Konzentrationen wirkt CTP als Inhibitor der ATCase über regulatorische oder allosterische Stellen, nicht über aktive Stellen. Dies ist ein Beispiel für eine negative Rückkopplung, bei der das Endergebnis die Ausgangsreaktion aufhebt. Die Rückkopplungshemmung von CTP auf ATCase kann durch ATP rückgängig gemacht werden.
Heterotrope Effekte — Effekte von Nicht-Substratmolekülen auf das Enzym
Kooperativität
Die Rate der Produktbildung N-Carbamoylaspartat steigt mit zunehmender Konzentration von Aspartat. Da es einen kooperativen Charakter hat, kann man sehen, dass seine Kurve ein sigmodales Merkmal aufweist, was bedeutet, dass die Bindung eines Substrats an eine Stelle der Moleküle die Affinität für die anderen Substrate erhöht, sich an die anderen Bindungsstellen der Moleküle zu binden. Die sigmodale Kurve von ATCase enthält eine Mischung aus zwei Michaelis-Menten-Kurven – eine mit einem hohen KM-Wert (dargestellt durch den T-Zustand), die andere mit einem niedrigen KM-Wert (dargestellt durch den R-Zustand). Die Bindung eines Substrats an eine Untereinheit und die daraus resultierende Veränderung aller anderen Untereinheiten wird als Kooperativität bezeichnet. Bei der Kooperativität wird durch die Bindung an einer Stelle die Bindung an einer anderen Stelle des Enzyms verstärkt oder vermindert. Dies ist auf die Konformationsänderungen der benachbarten Untereinheiten zurückzuführen, die sich auf die Formveränderung der anderen katalytischen Untereinheit auswirken. Dieser Prozess ist analog dazu, wie Hämoglobin kooperativ Sauerstoffmoleküle bindet.
MechanismEdit
Das Enzym hat zwei aktive Stellen. Eine ist für das Substrat und die andere für den allosterischen Aktivator, der sich an der Regulationsstelle befindet. Die aktive Stelle des Enzyms kann das Substrat nicht binden, wenn die allosterischen Aktivatoren nicht an die regulatorische Stelle gebunden sind. Bindet der allosterische Aktivator hingegen an das Enzym, das die Form der aktiven Stelle hat, ermöglicht er die Bindung des Substrats, so dass Produkte gebildet werden können. Das Enzym bleibt so lange aktiv, bis der allosterische Aktivator das Enzym verlässt.