Biochimica strutturale/Regolazione dell’enzima/Controllo allosterico
Il controllo allosterico si riferisce a un tipo di regolazione dell’enzima che coinvolge il legame di una molecola non substrato, conosciuta come l’effettore allosterico, in posizioni sull’enzima diverse dal sito attivo. Il nome “allo” significa altro e “sterico” si riferisce a una posizione in un certo spazio. In altre parole, allosterico significa “in un altro luogo”. Un sito allosterico è un sito in cui una piccola molecola di regolazione interagisce con un enzima per inibire o attivare quello specifico enzima; che è diverso dal sito attivo dove si verifica l’attività catalitica. Il legame dell’effettore allosterico è in generale non covalente e reversibile. Questa interazione cambia quindi la forma dell’enzima che, a sua volta, cambia la forma del sito attivo. Questo cambiamento di conformazione inibisce o aumenta la catalisi di una reazione. Così il controllo allosterico permette alla cellula di regolare rapidamente le sostanze necessarie attraverso l’inibizione e o il potenziamento.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. L’effetto inibitorio del CTP, l’azione stimolatoria dell’ATP e il legame cooperativo dei substrati sono tutti accompagnati da grandi cambiamenti nella struttura quaternaria dell’ATCasi.
- Ogni catena r di ogni subunità di regolazione si lega con una catena c del trimero catalitico. La regione di contatto tra la catena r e la catena c è stabilizzata da un dominio di zinco legato a residui di istidina nella catena r. Tutte le catene c sono in contatto con la subunità regolatoria.
Le subunità catalitiche e regolatorie possono essere separate aggiungendo prima un composto mercuriale e poi mediante ultracentrifugazione. I composti mercuriali rompono la connessione perché spostano lo ione Zinco, destabilizzando il dominio della subunità r. La reazione non segue un comportamento di Michaelis-Menten, ma produce una curva sigmoidale a causa dei cambiamenti di risposta nella concentrazione del substrato attraverso la regolazione di altre molecole e dei cambiamenti nella probabilità di legame. L’aggiunta di più substrato ha due effetti sull’aumento della probabilità che l’enzima leghi più di una molecola di substrato mentre aumenta la quantità media di substrati legati a ciascun enzima. Più substrato in definitiva favorisce lo stato R dell’ATCase poiché l’equilibrio dipende dal numero di siti attivi che sono occupati dal substrato, il che è completamente opposto al comportamento di Michaelis-Menten.
KineticsEdit
Gli enzimi allosterici mostrano una cinetica sigmoidale piuttosto che la cinetica di Michaelis-Mentone. Questo perché l’enzima oscilla tra due stati conformazionali distinti, proprio come l’emoglobina.
- Lo stato T è caratterizzato da una bassa affinità del substrato e da una bassa attività catalitica.
- Nella conformazione dello stato R, c’è una separazione di 12Å tra i trimeri catalitici, e una rotazione di circa 10° intorno all’asse centrale. C’è anche una rotazione di circa 15° da parte delle subunità di regolazione. La conformazione dello stato R è caratterizzata da un aumento della concentrazione del substrato che aumenta simultaneamente la reattività di ATCase in preparazione per il percorso enzimatico di produzione del CTP.
Attivazione AllostericaModifica
Su legame del substrato al sito attivo situato nella tasca tra le catene c nel trimero, ATCase ha una maggiore probabilità di passare allo stato R a causa del legame del substrato che stabilizza lo stato R. Il legame dei substrati sposta l’equilibrio più verso lo stato R aumentando la probabilità
che ogni enzima si leghi e aumentando il numero medio di substrati legati (cooperatività).
L’ATP può anche legarsi al sito regolatore dell’ATCase, ma l’ATP non inibisce l’attività dell’ATCase, infatti l’ATP aumenta l’attività dell’ATCase. Quindi ad alti livelli di ATP, l’ATP può agire come un concorrente, per il sito regolatore, contro il CTP. Quindi l’attività dell’ATCasi può aumentare con l’aumento della concentrazione di ATP. Questo aumento di attività può avere potenziali spiegazioni fisiologiche. Alti livelli di ATP significano che c’è un’alta concentrazione di nucleotidi purinici, quindi l’aumentata attività dell’ATCasi aumenterà la concentrazione di pirimidine. Quindi la concentrazione di purine e pirimidine sarà più equilibrata. Inoltre avere molto ATP nella cellula significa avere energia per processi come la sintesi dell’mRNA e anche la replicazione del DNA, quindi l’ATCasi può aumentare le quantità di pirimidine che possono poi essere utilizzate in questi processi.
PALAEdit
In presenza di N-(fosfonacetil)-L-asparato (PALA), un analogo bisubstrato che assomiglia al substrato intermedio sul percorso enzimatico, PALA inibisce ATCase che si lega ai siti attivi. L’inibizione, tuttavia, ha rivelato il cambiamento nella struttura quaternaria al momento del legame di PALA. Due trimeri catalitici sono isolati nei loro rispettivi stati T e R. Questa inibizione non è allosterica, ma invece, introduce le subunità catalitiche che sono responsabili dell’inibizione allosterica di questa via di inibizione di feedback completa.
Lo stato T vs. lo stato RLo stato T è noto per tendere la molecola che aumenta la quantità di substrato necessaria per legarsi all’enzima a 1/2 Vmax (Km). Lo stato T è meno attivo ed è favorito dal legame del CTP. L’effetto del CTP è che lo stato T si stabilizza. Questo significa che è più difficile convertire l’enzima allo stato R. D’altra parte, lo stato R è noto per essere più rilassato e diminuisce il Km. Quando la concentrazione del substrato aumenta, l’equilibrio si sposta dallo stato T allo stato R. Allo stato R, la molecola è più attiva, il che significa che il legame del substrato è favorito. L’effetto dell’ATP sullo stato R è che viene stabilizzato, il che rende più facile il legame dei substrati.
Effetti omotropici — effetti del substrato sugli enzimi allosterici.
Effetti eterotropi —Gli effetti di molecole non substrato sugli enzimi allosterici come il CTP e l’ATP su ATCase
Inibizione allostericaModifica
Trifosfato di Citidina (CTP), il prodotto finale di ATCase agisce come un regolatore allosterico. Il carbamoil fosfato e l’aspartato si condensano nell’intermedio N-carbamoilaspartato che poi forma il CTP. Il CTP si lega alla catena r della subunità regolatrice non in contatto con le catene c. Il legame del CTP stabilizza lo stato T e diminuisce l’affinità del substrato. Anche se il sito di legame alla subunità regolatoria è distante dalla subunità catalitica, il legame provoca cambiamenti strutturali quaternari che promuovono la stabilizzazione dello stato T e l’inibizione. Così, causa lo spostamento a destra della curva sigmoidale. La reazione avverrà velocemente ad una bassa concentrazione di , ma a concentrazioni più alte, il CTP agirà come un inibitore dell’ATCasi tramite siti regolatori o allosterici, non siti attivi. Questo è un esempio di feedback negativo, dove il risultato finale terminerà la reazione iniziale. L’inibizione di feedback del CTP sull’ATCasi può essere invertita dall’ATP.
Effetti eterotropi — effetti di molecole non substrato sull’enzima
CooperativitàModifica
Il tasso di formazione del prodotto N-carbamoilaspartato aumenta all’aumentare della concentrazione di Aspartato. Poiché ha carattere cooperativo, si può vedere che la sua curva ha la caratteristica sigmodale che significa che il legame del substrato su un sito delle molecole aumenta l’affinità per gli altri substrati di legarsi agli altri siti di legame delle molecole. La curva sigmodiale di ATCase incorpora un mix di due curve di Michaelis-Menten: una con un alto valore di KM (mostrato attraverso lo stato T), l’altra con un basso valore di KM (mostrato attraverso lo stato R). Il legame di un substrato a una subunità e la conseguente alterazione di tutte le altre subunità si chiama cooperatività. Nella cooperatività, il legame in un sito aumenta o diminuisce il legame in un altro sito dell’enzima. Ciò è dovuto ai cambiamenti conformazionali dei residui delle subunità vicine che influenzano il cambiamento di forma dell’altra subunità catalitica. Questo processo è analogo a come l’emoglobina lega cooperativamente le molecole di ossigeno.
MechanismEdit
L’enzima ha due siti attivi. Uno è per il substrato e l’altro è per l’attivatore allosterico che si trova nel sito regolatore. Il sito attivo dell’enzima non può legare il substrato quando gli attivatori allosterici non sono legati al sito regolatore. D’altra parte, se l’attivatore allosterico si lega all’enzima, la forma del sito attivo, permette al substrato di legarsi permettendo ai prodotti di essere prodotti. L’enzima rimarrà attivo finché l’attivatore allosterico non lascerà l’enzima.