Structurele biochemie/Enzymregulatie/Allosterische controle
Allosterische controle verwijst naar een type enzymregulatie waarbij een niet-substraatmolecuul, bekend als de allosterische effector, wordt gebonden op andere plaatsen op het enzym dan de actieve site. De naam “allo” betekent ander en “sterisch” verwijst naar een positie in een bepaalde ruimte. Met andere woorden, allosterisch betekent “op een andere plaats”. Een allosterische plaats is een plaats waar een kleine regulerende molecule interageert met een enzym om dat specifieke enzym te remmen of te activeren; dat is anders dan de actieve plaats waar de katalytische activiteit plaatsvindt. De binding van de allosterische effector is in het algemeen niet-covalent en omkeerbaar. Deze interactie verandert dus de vorm van het enzym, die op zijn beurt de vorm van de actieve site verandert. Deze verandering van conformatie zal de katalyse van een reactie ofwel afremmen ofwel versterken. De allosterische controle stelt de cel dus in staat de benodigde stoffen snel te reguleren door remming en of versterking.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. De remmende werking van CTP, de stimulerende werking van ATP, en de coöperatieve binding van substaten gaan alle gepaard met grote veranderingen in de quaternaire structuur van ATCase.
- Elke r-keten van elke regulatoire subeenheid bindt met een c-keten van de katalytische trimeer. Het contactgebied tussen de r-keten en de c-keten wordt gestabiliseerd door een zinkdomein dat aan histidineresiduen in de r-keten is gebonden. Alle c-ketens hebben contact met de regulatoire subeenheid.
De katalytische en regulatoire subeenheden kunnen worden gescheiden door eerst een kwikverbinding toe te voegen en vervolgens door ultracentrifugatie. De kwikverbindingen verbreken de verbinding doordat ze het zinkion verdringen, waardoor het r-subeenheid domein destabiliseert. De reactie volgt geen Michaelis-Menten gedrag, maar geeft een sigmoïdale curve vanwege de reactieveranderingen in de substraatconcentratie via regulatie door andere moleculen en van de veranderingen in de bindingswaarschijnlijkheid. De toevoeging van meer substraat heeft twee effecten: de kans dat het enzym meer dan één substraatmolecuul bindt neemt toe, terwijl de gemiddelde hoeveelheid substraten die aan elk enzym wordt gebonden toeneemt. Meer substraat begunstigt uiteindelijk de R-staat van ATCase, aangezien het evenwicht afhangt van het aantal actieve plaatsen dat door het substraat wordt bezet, hetgeen volledig tegengesteld is aan het Michaelis-Menten gedrag.
KineticsEdit
Allosterische enzymen vertonen een sigmoïdale kinetiek in plaats van een Michaelis-Menton-kinetiek. Dit komt doordat het enzym schommelt tussen twee verschillende conformatiestadia, net als hemoglobine.
- De T-toestand wordt gekenmerkt door een lage substraataffiniteit en een lage katalytische activiteit.
- In de R-toestand is er een 12Å scheiding tussen de katalytische trimeren, en een rotatie van ongeveer 10° om de centrale as. Er is ook een rotatie van ongeveer 15° door de regulerende subeenheden. De R-staat-conformatie wordt gekenmerkt door een toename van de substraatconcentratie die tegelijkertijd de reactiviteit van ATCase verhoogt ter voorbereiding op de enzymatische route van het produceren van CTP.
Allosteric ActivationEdit
Bij substraatbinding aan de actieve site die zich bevindt in de pocket tussen de c-ketens in de trimer, heeft ATCase een grotere kans om naar de R-staat te verschuiven doordat substraatbinding de R-staat stabiliseert. De binding van substraten verschuift het evenwicht meer in de richting van de R-toestand door de kans
dat elk enzym bindt te vergroten en het gemiddelde aantal gebonden substraten te verhogen (coöperativiteit).
ATP kan zich ook binden aan de regulerende plaats van ATCase, maar ATP remt de activiteit van ATCase niet, integendeel, ATP verhoogt de activiteit van ATCase. Dus bij hoge ATP-niveaus kan ATP fungeren als een concurrent, voor de regulatorische plaats, tegen CTP. Dus de activiteit van ATCase kan toenemen met verhoogde concentratie van ATP. Deze toename van activiteit kan mogelijk fysiologische verklaringen hebben. Een hoog ATP-niveau betekent dat er een hoge concentratie purinenucleotiden is, zodat de verhoogde ATCase-activiteit de concentratie pyrimidines zal doen toenemen. Dus de concentratie van zowel purines als pyrimidines zal meer in evenwicht zijn. Veel ATP in de cel betekent ook energie voor processen als mRNA-synthese en DNA-replicatie, zodat ATCase de hoeveelheid pyrimidines kan verhogen, die dan voor deze processen kunnen worden gebruikt.
PALAEdit
In aanwezigheid van N-(fosfonacetyl)-L-asparaat (PALA), een bisubstraatanaloog dat lijkt op het substraattussenproduct op de enzymatische route, remt PALA ATCase dat zich aan de actieve plaatsen bindt. De remming bracht echter de verandering in de quaternaire structuur aan het licht bij binding van PALA. Twee katalytische trimeren worden geïsoleerd in hun respectieve T- en R-toestanden. Deze remming is niet allosterisch, maar introduceert de katalytische subeenheden die verantwoordelijk zijn voor de allosterische remming van deze complete terugkoppelingsremmingsroute.
T-toestand vs. R-toestandDe T-toestand staat erom bekend het molecuul op te spannen, waardoor de hoeveelheid substraat die nodig is om zich aan het enzym te binden bij 1/2 Vmax (Km) toeneemt. De T-staat is minder actief en wordt begunstigd door CTP-binding. Het effect van CTP is dat de T-toestand wordt gestabiliseerd. Dit betekent dat het moeilijker is om het enzym om te zetten in de R-staat. Anderzijds is bekend dat de R-staat meer ontspannen is en de Km verlaagt. Naarmate de concentratie van het substraat toeneemt, verschuift het evenwicht van de T-toestand naar de R-toestand. In de R-staat is het molecuul actiever, wat betekent dat de substraatbinding wordt bevorderd. Het effect van ATP op de R-toestand is dat deze wordt gestabiliseerd, waardoor het binden van substraten gemakkelijker wordt.
Homotrope effecten — substraateffecten op allosterische enzymen.
Heterotrope effecten —de effecten van niet-substraatmoleculen op allosterische enzymen, zoals CTP en ATP op ATCase
Allosterische remmingEdit
Cytidine trifosfaat (CTP), het eindproduct van ATCase, werkt als een allosterische regulator. Carbamoylfosfaat en aspartaat condenseert tot N-carbamoylaspartaat intermediair dat vervolgens CTP vormt. CTP bindt aan de r-keten van de regulerende subeenheid die niet in contact staat met de c-ketens. De binding van CTP stabiliseert de T-toestand en vermindert de substraataffiniteit. Hoewel de bindingsplaats op de regulerende subeenheid ver verwijderd is van de katalytische subeenheid, zal de binding resulteren in quaternaire structuurveranderingen die de stabilisatie van de T-toestand en de remming bevorderen. Hierdoor verschuift de sigmoïdale curve naar rechts. De reactie zal snel verlopen bij een lage concentratie van , maar bij hogere concentraties zal CTP werken als een remmer van ATCase door regulatorische of allosterische sites, niet actieve sites. Dit is een voorbeeld van negatieve terugkoppeling, waarbij het eindresultaat de startreactie zal beëindigen. De terugkoppelingsremming van CTP op ATCase kan door ATP ongedaan worden gemaakt.
Heterotrope effecten — effecten van niet-substraatmoleculen op enzym
CooperativiteitEdit
De snelheid van de productvorming N-carbamoylaspartaat neemt toe naarmate de concentratie van aspartaat toeneemt. Aangezien het een coöperatief karakter heeft, kun je zien dat de curve de sigmodale eigenschap heeft dat betekent dat de binding van substraat op één plaats van de moleculen de affiniteit verhoogt voor de andere substraten om zich te binden aan de andere bindingsplaatsen van de moleculen. De sigmodale curve van ATCase is een mengeling van twee Michaelis-Menten-curven – één met een hoge waarde van KM (weergegeven door de T-toestand), de andere met een lage waarde van KM (weergegeven door de R-toestand). De binding van een substraat aan een subeenheid en de daaruit voortvloeiende verandering van alle andere subeenheden wordt coöperativiteit genoemd. Bij coöperativiteit verhoogt of verlaagt binding op één plaats de binding op een andere plaats van het enzym. Dit is het gevolg van de conformatieveranderingen van de naburige subeenheidresiduen die de vormverandering van de andere katalytische subeenheid beïnvloeden. Dit proces is analoog aan de manier waarop hemoglobine coöperatief zuurstofmoleculen bindt.
MechanismEdit
Het enzym heeft twee actieve sites. De ene is voor het substraat en de andere is voor de allosterische activator, die zich op de regulatieplaats bevindt. De actieve site van het enzym kan het substraat niet binden als de allosterische activatoren niet aan de regulatorische site zijn gebonden. Anderzijds, als de allosterische activator aan het enzym bindt, maakt de vorm van de actieve site het mogelijk dat het substraat bindt waardoor producten kunnen worden geproduceerd. Het enzym blijft actief totdat de allosterische activator het enzym verlaat.