Strukturell biokemi/Enzymreglering/Allosterisk kontroll
Allosterisk kontroll är en typ av enzymreglering som innebär att en icke-substratmolekyl, en så kallad allosterisk effektor, binds på andra ställen på enzymet än den aktiva platsen. Namnet ”allo” betyder annan och ”sterisk” avser en position i ett visst utrymme. Allosterisk betyder med andra ord ”på en annan plats”. En allosterisk plats är en plats där en liten reglerande molekyl interagerar med ett enzym för att hämma eller aktivera det specifika enzymet; vilket skiljer sig från den aktiva platsen där katalytisk aktivitet sker. Bindningen av den allosteriska effektorn är i allmänhet icke-kovalent och reversibel. Interaktionen ändrar alltså enzymets form, vilket i sin tur ändrar formen på den aktiva platsen. Denna konformationsförändring kommer antingen att hämma eller förstärka katalysen av en reaktion. Den allosteriska kontrollen gör det alltså möjligt för cellen att snabbt reglera de nödvändiga ämnena genom hämning och/eller förstärkning.
ATCaseEdit
The enzyme aspartate transcarbamoylase (ATCase) is an allosteric enzyme that catalyzes the first step in the synthesis of pyrimidines.
StructureEdit
ATCase is made of six regulatory subunits and six catalytic subunits. The 3 regulatory subunits (r) are dimers made of 2 chains of 17 kd each. The smaller of the two, the regulatory subunit can bind to CTP and thus shows no catalytic activity. The 2 catalytic subunits (c) are trimers consisting of 3 chains, each 34 kd. The catalytic subunit is unresponsive to CTP thus does not follow a sigmoidal behavior.
- The quaternary structure of ATCase is composed of the two catalytic trimers stacked one on top of another. Den hämmande effekten av CTP, den stimulerande effekten av ATP och den kooperativa bindningen av substater åtföljs alla av stora förändringar i ATCasets kvaternära struktur.
- Varje r-kedja av var och en av de regulatoriska underenheterna binder med en c-kedja av den katalytiska trimern. Kontaktområdet på mellan r-kedjan och c-kedjan stabiliseras av en domän av zink som är bunden till histidinrester i r-kedjan. Alla c-kedjor har kontakt med den regulatoriska underenheten.
De katalytiska och regulatoriska underenheterna kan separeras genom att först tillsätta en kvicksilverförening och sedan genom ultracentrifugering. Kvicksilverföreningar bryter förbindelsen eftersom den förskjuter zinkjonen, vilket destabiliserar r-underenhetens domän. Reaktionen följer inte ett Michaelis-Menten-beteende, utan ger i stället en sigmoidal kurva på grund av responsförändringarna i substratkoncentrationen via reglering av andra molekyler och av förändringarna i bindningssannolikheten. Tillsatsen av mer substrat har två effekter på att öka sannolikheten att enzymet binder mer än en substratmolekyl samtidigt som den genomsnittliga mängden substrat som binds till varje enzym ökar. Mer substrat gynnar i slutändan ATCasets R-tillstånd eftersom jämvikten beror på antalet aktiva platser som är upptagna av substratet, vilket är helt motsatt Michaelis-Mentens beteende.
KineticsEdit
Allosteriska enzymer uppvisar sigmoidal kinetik snarare än Michaelis-Menton-kinetik. Detta beror på att enzymet oscillerar mellan två distinkta konformationstillstånd, ungefär som hemoglobin.
- T-tillståndet kännetecknas av låg substrataffinitet och låg katalytisk aktivitet.
- I R-tillståndskonformationen finns det en 12Å-avskiljning mellan katalytiska trimerer och en rotation på ungefär 10° kring den centrala axeln. Det finns också en ungefär 15° rotation av de regulatoriska subenheterna. R-tillståndskonformationen kännetecknas av att en ökning av substratkoncentrationen samtidigt ökar ATCasets reaktivitet som förberedelse för den enzymatiska vägen att producera CTP.
Allosteric ActivationEdit
När substratbindning sker vid den aktiva platsen som är belägen vid fickan mellan c-kedjorna i trimeren, har ATCaset större sannolikhet att skifta till R-tillståndet på grund av att substratbindningen stabiliserar R-tillståndet. Bindning av substrat förskjuter jämvikten mer mot R-tillståndet genom att öka sannolikheten
att varje enzym kommer att binda och öka det genomsnittliga antalet bundna substrat (kooperativitet).
ATP kan också binda till ATCasets regulatoriska plats, men ATP hämmar inte ATCasets aktivitet, i själva verket ökar ATP ATCasets aktivitet. Så vid höga nivåer av ATP kan ATP fungera som en konkurrent,för den regulatoriska platsen, mot CTP. ATCasets aktivitet kan alltså öka med ökad koncentration av ATP. Denna ökning av aktiviteten kan ha potentiella fysiologiska förklaringar. Höga nivåer av ATP innebär att det finns en hög koncentration av purinnukleotider, så den ökade ATCase-aktiviteten kommer att öka koncentrationen av pyrimidiner. Koncentrationen av både puriner och pyrimidiner kommer alltså att vara mer balanserad. Att ha mycket ATP i cellen innebär också att ha energi för processer som mRNA-syntes och även DNA-replikation, så ATCaset kan öka mängderna pyrimidiner som sedan kan användas i dessa processer.
PALAEdit
I närvaro av N-(fosfonacetyl)-L-asparat (PALA), en bisubstratanalog som liknar substratintermediären på den enzymatiska vägen, hämmar PALA ATCaset som binder sig till de aktiva platserna. Hämningen avslöjade dock förändringen i den kvartära strukturen vid bindning av PALA. Två katalytiska trimerer isoleras i sina respektive T- och R-tillstånd. Denna hämning är inte allosterisk, utan introducerar istället de katalytiska subenheter som är ansvariga för den allosteriska hämmningen av denna kompletta återkopplingshämmningsväg.
T-tillstånd vs. R-tillståndT-tillståndet är känt för att spänna upp molekylen vilket höjer mängden substrat som behövs för att binda till enzymet vid 1/2 Vmax (Km). T-tillståndet är mindre aktivt och gynnas av CTP-bindning. Effekten av CTP är att T-tillståndet stabiliseras. Detta innebär att det är svårare att omvandla enzymet till R-tillstånd. Å andra sidan är R-tillståndet känt för att vara mer avslappnat och minskar Km. När koncentrationen av substratet ökar kommer jämvikten att förskjutas från T-tillståndet till R-tillståndet. I R-tillstånd är molekylen mer aktiv, vilket innebär att substratbindning gynnas. Effekten av ATP på R-tillståndet är att det stabiliseras, vilket gör det lättare att binda substrat.
Homotropa effekter — substrateffekter på allosteriska enzymer.
Heterotropa effekter —Effekter av icke-substratmolekyler på allosteriska enzymer såsom CTP och ATP på ATCase
Allosterisk hämningEdit
Cytidintrifosfat (CTP), slutprodukten av ATCase, fungerar som en allosterisk regulator. Karbamoylfosfat och aspartat kondenseras till N-karbamoylaspartat som sedan bildar CTP. CTP binder till r-kedjan i den regulatoriska underenheten som inte är i kontakt med c-kedjorna. Bindningen av CTP stabiliserar T-tillståndet och minskar substrataffiniteten. Även om bindningsstället vid den regulatoriska underenheten är avlägset från den katalytiska underenheten kommer bindningen att resultera i kvaternära strukturella förändringar som främjar stabiliseringen av T-tillståndet och hämning. Det leder således till att den sigmoidala kurvan förskjuts till höger. Reaktionen kommer att ske snabbt vid en låg koncentration av , men vid högre koncentrationer kommer CTP att verka som en hämmare för ATCas genom reglerande eller allosteriska platser, inte aktiva platser. Detta är ett exempel på negativ återkoppling, där slutresultatet avslutar den påbörjade reaktionen. CTP:s återkopplingshämning av ATCase kan upphävas med ATP.
Heterotropa effekter — effekter av icke-substratmolekyler på enzymet
CooperativityEdit
Hastigheten för produktbildningen N-carbamoylaspartat ökar när koncentrationen av aspartat ökar. Eftersom den har kooperativ karaktär kan man se att dess kurva har den sigmodala egenskapen som innebär att bindningen av substratet på en plats av molekylerna ökar affiniteten för de andra substraten att binda till de andra bindningsställena av molekylerna. Den sigmodala kurvan för ATCase innehåller en blandning av två Michaelis-Menten-kurvor – en med ett högt värde på KM (visas genom T-tillståndet), den andra med ett lågt värde på KM (visas genom R-tillståndet). Bindningen av ett substrat till en subenhet och den därav följande förändringen av alla andra subenheter kallas kooperativitet. Vid kooperativitet ökar eller minskar bindningen på en plats bindningen på en annan plats i enzymet. Detta beror på konformationsförändringar hos de angränsande underenhetsresterna som påverkar formförändringen hos den andra katalytiska underenheten. Denna process är analog med hur hemoglobin kooperativt binder syremolekyler.
MechanismEdit
Enzymet har två aktiva platser. Den ena är för substrat och den andra för den allosteriska aktivatorn som finns på den regulatoriska platsen. Den aktiva platsen för enzymet kan inte binda substratet när allosteriska aktivatorer inte är bundna till den regulatoriska platsen. Å andra sidan, om den allosteriska aktivatorn binder till enzymet, den aktiva platsens form, gör det möjligt för substratet att binda så att produkter kan produceras. Enzymet förblir aktivt tills den allosteriska aktivatorn lämnar enzymet.